Desmond e uma aspirante a assassina, Lucy Stillman, escapam do laboratório de Abstergo, seguindo para um esconderijo dos assassinos. Desmond descobre que os assassinos, com poucos recursos e dinheiro, estão tendo dificuldades para vencer os templários. Stillman, um dos assassinos, revela que ela e uma nova equipe têm trabalhado em um novo dispositivo, o Animus 2.0. Desmond então vê as memórias de um novo assassino através da nova máquina.

O jogador assume o papel de um jovem nobre que se tornou assassino, chamado Ezio Auditore. O pai de Ezio e seus irmãos, acusados de trair a cidade de Florença, são executados em praça pública. Ezio também seria executado, porém conseguiu escapar da morte. Ezio então parte junto com sua mãe e sua irmã para a vila dos Auditore, onde descobre que seus irmãos e seu pai eram secretamente assassinos. Ezio passa a ajudar seu tio Mario na guerra entre os templários e os assassinos, com o intuito de se vingar dos causadores da morte de sua família.^[11] Como Altair no primeiro jogo, Ezio é um ascendente de Desmond Miles, o barman dos dias modernos que foi capturado em Abstergo, com o próprio Ezio sendo descendente de Altair.

O jogo se passa no século XV, na Itália, durante o Renascimento, aproximadamente trezentos anos após o primeiro jogo.^[10] Como Assassin's Creed, os personagens baseados em figuras históricas estão presentes no jogo incluindo Leonardo da Vinci, Niccolò Machiavelli, Catarina Sforza, Lorenzo de' Medici e Rodrigo Bórgia. Ao contrário de Altair, o qual o dedo anelar foi amputado para acomodar o uso de sua lâmina escondida, Ezio tem o seu dedo o qual ostenta um anel com o brasão de sua amada.