A história total dentro do Assassin's Creed é ajustada em Setembro de 2012, onde Desmond Miles (o personagem controlado pelo jogador) foi sequestrado por uma pessoa desconhecida antes do começo do jogo e trazido às indústrias de Abstergo, onde os investigadores estão trabalhando no projeto do Animus. O Animus pode retirar memórias do DNA do usuário, permitindo que o usuário recupere estas memórias como se ele mesmo estivesse lá. Desmond foi "escolhido" para o projeto devido ao fato de ser descendente direto de Altaïr, um membro da ordem dos assassinos durante a terceira Cruzada da Terra Santa; os investigadores expressam o interesse em compreender mais de como os assassinos trabalharam. Embora inicialmente o inconsciente de Desmond rejeite as memórias de Altaïr, ele eventualmente aprende a aceitá-las e pode prosseguir com as ações de Altaïr com o Animus, podendo ficar cada vez mais tempo na máquina.

As memórias de Altaïr que Desmond experimenta são do começo do Ano de 1191: Ricardo Coração de Leão recapturou apenas a cidade portuária de Acre para conquistar os muçulmanos. Com uma base das operações estabelecidas, os cruzados preparam-se para marchar para o sul. O seu alvo verdadeiro é Jerusalém - que pretende recapturar para o Cristianismo. Porém as forças muçulmanas estão a se reunir nas ruínas de Arsuf, pretendendo fazer uma emboscada aos cruzados e impedir que alcancem Jerusalém. Quando Ricardo e Saladino combatem um com outro, os homens deixados a governar em seu lugar começam a fazer exame da vantagem de suas posições do poder.

As primeiras experiências de Desmond na memória são aquelas de Altaïr quase assassinando o grão-mestre Cavaleiros dos Templários, Robert de Sable, quando está em busca de um artefato misterioso que seu mestre o manda buscar para os Assassinos. Devido a sua arrogância Altair se precipita e os Templários descobrem que ele e mais dois irmãos (no sentido de pertencerem a mesma ordem) estavam lá. Numa atitude também precipitada tenta matar Robert de Sable mas falha, Robert o joga longe e como estão em ruínas o lado em que Altair cai desaba e o separa de seus irmãos Assassinos, Malik e seu irmão. Quando Altair volta a Ordem dos Assassinos sem o artefato e sem os outros Assassinos começa a levar um sermão de Al Mualim mas de repente Malik chega com um braço ferido e incrivelmente com o objeto em questão em mãos, acusando Altair de sua arrogancia ter matado seu irmão mais novo. Devido a isto, Altaïr é demovido a Uninitiated ("Não-iniciado") - o Rank o mais baixo na ordem dos assassinos. Mas Al Mualim, líder dos assassinos, oferece-lhe uma oportunidade de reconquistar a sua honra. Altaïr deve arriscar-se na Terra Santa, assassinar nove homens e explorar as hostilidades criadas pela Terceira Cruzada. Ao fazer isto, estabilizaria a região, permitindo que Mualim viva em uma cidade da paz (seu rank como assassino é devolvido após completar uma missão, ou seja, assassinar o alvo).

Ao longo da trama, Altaïr descobre que seus alvos são definidos mais do que apenas por um interesse compartilhado no ganho pessoal, mas está no fato de os Templários terem como objetivo a união de toda a humanidade sob uma causa comum. Paralelamente, Desmond aprende dos e-mails que lê entre as sessões no Animus, que as indústrias de Abstergo são atualmente dirigidas por Templários modernos, e que ao procurar as localizações de diversos artefatos, conhecidos como as "Pedaços do Éden", eles podem continuar lutando pelos objetivos dos Templários.

Desmond vê que foi sequestrado pela companhia, de modo que possa aprender, com as memórias de Altaïr, onde estão os outros pedaços do Éden, que podem estar enterradas em qualquer lugar do mundo. Encontra também restos da ordem dos assassinos em dias modernos, que tinham tentado recuperar antes que a informação fosse obtida pelos modernos templários.

As memórias de Altaïr revelam finalmente que as tarefas que cumpriu eram uma armadilha dos Templários para semear o desacordo entre os assassinos, os cruzados e os muçulmanos. Ao fazer isto, Saladino e Ricardo Coração de Leão trabalhariam preferencialmente juntos e no processo, trariam a paz para o Templários. Altaïr alcança finalmente Robert de Sable, seu último alvo atribuído, e derrota-o. Robert de Sable revela em suas palavras, morrendo, que o mestre de Altaïr é também um membro do Templários, e tem agora o único poder do artefato, o "Pedaço do Éden" que pode se alterar o que homens podem ver e podem ser usados para a hipnose coletiva (é revelado ao final do jogo que Al Mualim usou Altaïr e os outros da irmandade para matar os homens influentes para ter o controle do reino para ele mesmo).

Altaïr viaja para enfrentar seu mestre, que está armado com a "Pedaço do Éden", tentando alterar a vista de Altaïr, mas cai eventualmente em sua lâmina. Porque Altaïr recupera a "Pedaço do Éden", o dispositivo ativa uma vez mais e revela posições múltiplas no globo de forma holográfica (inclusive duas posições em continentes que já não existem em 2012, o mapa mostra até mesmo a divisão atual dos países em 2012).

Com a memória de Altaïr completa, Desmond acorda fora do Animus para aprender que as indústrias de Abstergo estão enviando as equipes da recuperação para aquelas duas posições e esperam encontrar artefatos adicionais. Em um determinado momento, Desmond lê um e-mail no quarto de conferência que detalha a falha na recuperação de outras três Partes de Eden, tudo tendo por resultado acidentes desastrosos, dois tendo por resultado a experiência de Filadélfia e o evento de Tunguska. O e-mail fala também do Santo Graal, indicando haver evidência insuficiente para confirmar sua existência, e dos "Os Comunicadores Mitchell-Hedges", uma referência aos Mitchell-Hedges do F.A..

Desmond, por não ser mais útil para as indústrias de Abstergo, deve ser silenciado; entretanto, é conservado por Lucy Stillman, que revela ser ela própria uma assassina. Na conclusão do jogo, Desmond "sincroniza" tornando-se como Altaïr, que pode usar a visão de águia (uma espécie de visão empática para ver mensagens escondidas e para ver quem é amigo e quem é inimigo, vermelho=inimigo / azul=amigo / branco=cidadão que possui informações /dourado=alvo), isso se deve ao fato de que após muito tempo no Animus, a psiquê do ancestral e do descendente se misturam, e vê as mensagens rabiscadas através dos assoalhos e das paredes (estas mensagens foram escritas pelo "Subject 16" a última pessoa antes de Desmond (você) a usar o Animus, o indivíduo utiliza o próprio sangue para escrever tais mensagens) que somente pode ver aquele consultar à extremidade do mundo descrito por diversas religiões, entre outras escritas; tais escritas incluem referências ao texto bíblico Apocalipse 22:13 da passagem ("eu sou o Alfa e o Omega, o primeiro e o último, o começo e o fim."), um Lorenz Attractor, o olho da Divina Providência, e das outras escritas em línguas estrangeiras (chinês, alemão...). Adicionalmente, há a data Maia de 13.0.0.0 - 21 de dezembro de 2012, três meses antes o momento em que ocorre o jogo, que representa o último dia do calendário Maia além de outras mensagens desse tipo.