O jogador novamente controla o assassino Ezio Auditore da Firenze através de memórias genéticas de Desmond Miles utilizando o Animus 2.0. Mais missões dos tempos modernos serão introduzidas ao jogador ao longo da progressão da história principal. Como um mestre assassino, Ezio terá que reorganizar sua irmandade em Roma para lutar contra os templários. Haverá um modo de controle dos assassinos que permitirar-lhe enviar novos recrutas assassinos ao redor do mundo para lutar pelos seus ideais ou simplesmente utilizá-los como ajudantes em suas missões em Roma. Oferecer novos objetivos aos coadjuvantes é essencial para que eles evoluam e ganhem pontos de experiência, já que isso lhes proporcionará novas habilidades, roupas, armaduras e armas de longo e curto alcance. No entanto, mesmo Ezio sendo um mestre assassino neste episódio, suas habilidades ainda não estão perfeitas e ele ainda terá que aprender a usar novas máquinas, como o pára-quedas de Leonardo da Vinci, que poderá ser utilizado para pular de edifícios mais altos.

O jogador terá que reconstruir Roma, que está caíndo em ruínas graças ao governo corrupto dos Templários sobre os estados Papais, concentrando o poder no Vaticano. Assim como a vilarejo de Monteriggioni em Assassin's Creed II, Ezio terá a capacidade de investir na cidade para ganhar prêmios e forçar uma revolução, que contará agora com a ajuda do povo. O jogador terá que conquistar e destruir as torres do exército Borgia com o intuito de liberar regiões da cidade do domínio da família. Completando esses objetivos libera novas missões e oportunidades. Roma é a maior cidade já criada na série, sendo três vezes o tamanho de Florença de Assassin's Creed II e inclui 5 distritos variados: Vaticano, Downtown, Tiber, Country and Antique. Nehuma outra cidade ou mapa foram anunciadas como exploráveis, apesar de Monteriggioni aparecer no ínicio do jogo e Florença ser vista em fotos no modo multiplayer.

O modo de combate foi reformulado para ser mais rápido e dinâmico. Ataques furtivos e ações ofensivas serão mais mortais em Brotherhood do que no primeiros jogos, onde o contra-ataque parecia ser mais eficiente. A inteligência artificial se tornou mais agressiva, podendo ocorrer ataques simultâneos. Para matá-los, Ezio pode utilizar armas de longo e curto alcance ao mesmo tempo, introduzindo a Pistola ao combate mão-a-mão. O protagonista pode também jogar machados e outras armas aos seus inimigos. Novos arquétipos foram adicionados em relação a Assassin's Creed II, como os Guardas Papais, por exemplo. Novas técnicas mais letais de execução foram somadas as outras mais antigas, onde Ezio pode, por exemplo, atirar sua pistola praticamente dentro do crânio do oponente.

Os cavalos poderão agora entrar nas cidades, tendo um papel importantíssimo na criação de assassinatos, combates e sequências de fuga.